Quality Control Of Immuno Assay Test
مقدمه :
علم ایمنی شناسی که از مهمترین شاخه های علوم زیستی کمتر از یک قرن از عمر آن می گذرد و در حدود پنجاه سال بعنوان یک رشته مستقل در دانشکده پزشکی پدیدار گشته است که دستیابی به مولکول آنتی بادی و همچنین در مقابل آن آنتی بادی بوده تخلیص و جداسازی آنتی بادی های منوکلئو نرمال در مقابل پلی کلئونال راه اندازه گیری روشهای کمی را در مقابل روشهای کیفی هموار نمود.
)ایران و عرب کلمه ایمنی و همچنین در لاتین Immuno کلمه سانسکریت (روش Enzyme Immuneassay در مقابل روشهای قبل و بعد از خود روش راحتر و کارایی بیشتری داشته و توجه به روشهای دیگری که حتی شاید حساس تر بوده هنوز در استقبال فراوان تری برخوردار است و تنوع بیشتری را شامل می گردد.
در روش سنجش ایمنی بروش EIA از دستگاه خاصی بنام الایزا Elisa استفاده می گردد که مخفف Enzyme Linke Immuno Sorben Assay که شناسایی یک مولکول خاص آنتی ژن یا آنتی بادی Anti gen or Anti body و کمک یک آنزیم که اغلب از خانواده پراکسیدازها (HRP) Hours Redish prosidax تربچه کوهی که احیا کننده که رنگ بوجود آورده و انجام آن توسط پروتکل کیت که قبلا در یک میکروپلیت کد شده است بوجود می آید که دستگاه الایزا جهت خوانش رنگ بوجود آمده در مقابل رنگ استاندارد و داشتن منحنی استاندارد قابل محاسبه خواهد بود.
بدن انسان با تکیه بر سیستم ایمنی هومورال که آنتی بادی با اتصال اختصاصی بوجود می آورد هر مولکول ضد آن یعنی آنتی ژن بعنوان ابزاری برای ردیابی سریع در اختیار ما قرار داده است.
روشهای سنجش ایمنی Immunoassay توسط عمل باند شدن Ag+ Ab جز اصلی واکنش های سنجش ایمنی است که ماده نشاندار در الایزا یک آنزیم است.
کنترل کیفی در تستهای ایمونواسی ( EIA- RIA- FIA- CIA ) همانند هر آزمایش دیگر شامل ۳ مرحله خواهد بود:
شامل: آماده سازی بیمار، نمونه گیری، نگهداری، انتقال و آماده سازی نمونه.
شامل: منحنی استاندارد، محاسبه نتایج، مقادیر رفرانس، تفسیر نتایج
کنترل کیفی متغیرها ی قبل از انجام آزمایش:
این بررسی در تمام آزمایشات امونواسی برای همه روش ها صدق می کند.
بعضی هورمونها مثل GH , Prolactin , LH , TSH و بعضی دیگر در فواصل زمانی ۳۰ – ۵ دقیقه ترشح آنها بصورت ضربانی بوده و هربار به اوج رسیده و دوباره افت می کند (Feidback Negative) شاید این موضوع در مورد آزمایشات بیوشیمی نیز صدق کند ولی محدوده آنها بسار بالا بوده و چندان موثر نخواهد بود مسلماً زمان خونگیری جهت برری هورمونی در زمان اوج و افت کاملاً با هم متفاوت خواهد بود، در این مورد توصیه می شود ۲ تا ۳ بار با فاصله زمانی ۲۰ دقیقه بر حسب هورمون ( که زمان متغییر خواهد بود) از بیماران خون گرفته می شود و سرم های نمونه پس از جدا شدن به نسبت مساوی با هم مخلوط شده، تست بر روی نمونه این سرم انجام گیرد البته میتوان بر روی هر سه نمونه تست گذاشته و میانگین ریاضی جواب تست ها بعنوان جواب بیمار خواهد بود که روش اول مقرون به صرفه خواهد بود.
جهت نمونه گیری تستهای هورمونی بجز گاسترین نیازی به ناشتا بودن بیمار نیست ولی در موارد لیمپیک بودن شدید سرم توصیه شده تست بر روی نمونه ناشتا انجام شود.
بر اثر پاره شدن گلبول قرمز و آزاد شدن هموگلوبین سرم بر شدت همولیز قرمز رنگ می گردد. وجود همولیز در هر حال باعث اشکالاتی در تستهای هورمونی می شود.
الف) چون هموگلوبین از نظر فضایی مولکول بزرگی است زمان به تعادل رسیدن واکنش آنتی ژن- آنتی بادی را افزایش می دهد.
ب) چون ترکیبات سرم و گلبول قرمز متفاوت است در موارد همولیز شدید ترکیبات سرم طبیعی و همولیز از نظر مقادیر و درصد مواد متفاوت است ( درصد آب پروتئین، املاح و هورمونها )
ج) باقیماندن مقدار کمی از هموگلوبین در سرم تست های کمی لومینسانس سبب واکنش غیر اختصاصی می گردد. ( در موارد همولیز شدید شستشو قادر به خروج تمامی هموگلوبین سرم نیست).
د)هموگلوبین در روشهای CIA, FIA, EIA, RIA تداخل ایجاد می کند.
وجود غلظت بالای بیلروبین در سرم باعث پیدایش رنگ زرد تیره در سرم خواهد شد ، بیلروبین به دو نوع مستقیم و غیر مستقیم وجود دارد، وجود بیلروبین به علل گوناگون التهابی، ویروسی، جراحی، کمبود آنزیم و انسدادو یرقان نوزادان و غیره می تواند باشد.
بیلروبین از نظر شیمیایی مشابه مواد دترجنت عمل نموده و سبب اشکالات زیر می شود:
الف) در واکنش آنتی ژن- آنتی بادی جهت رسیدن به تعادل تداخل می کند.
ب) بیلروبین با قسمتهای هیدروفوب مولکولها واکنش داده و توزیع آنها را بر هم می زند.
ج) بیلروبین با غلظت بالا علاوه بر CIA در روشهای RIA, FIA, EIA هم تداخل ایجاد می کند.
در مورد سرم های ایکتر توصیه می شود تستهای هورمونی بعد از دفع یا بهبود یرقان تکرار شود یا با روشهای بررسی اثر تداخل و با انجام تستهای Reeovery و تستهای Parallel مقدار این تداخل را ارزیابی نمود.
ماندن سرم بر روی گلبولهای قرمز بیش از زمان استاندارد سبب تغییر غلظتهای برخی مواد در سرم می شود مانند هورمونهای تستوسترون باند شده و تستوسترون آزاد می شود لذا توصیه می شود پس از لخته شدن کامل در حرارت اطاق ظرف مدت نیم ساعت سرم جدا شود.
اغلب مواد ضد انعقاد مانند EDTA سبب تداخل تستهای هورمونی می شود.
الف) EDTA با برداشت یونهای فلزی Chelating عمل میکند ( Ca) که وجود برخی یونهای فلزی جهت عملکرد آنزیم ها ضروریست ( بصورت کوفاکتور) و در نتیجه استفاده از EDTA باعث تداخل در تمام روشها می گردد.
ب) مقدار آب سرم و پلاسما متفاوت است که این امر خود سبب اشکال در تعیین غلظت خواهد شد (Sampleing() در صورت نیاز به استفاده از پلاسما بجای سرم توصیه می شود از پلاسما هپارینه ( لیتوم هپارین ) که تداخل کمتری دارد استفاده شود.
چون مقدار آب، املاح، ترکیبات و مواد زمینه ای در سرم و پلاسما متفاوت است توصیه می شود جهت آزمایشات هورمونی از سرم استفاده گردد البته جهت بعضی از تست ها مانند Plama Rennin Activity (PRA) که می بایست از پلاسما استفاده شود جهت مقایسه نتایج تستهای هورمونی می توان از روشهای Parollel , Recovery استفاده شود.
مواد مهار کننده مانند فلزات سنگین یا بقایای آنها در داخل لوله تست و لوله خونگیری و جداسازی سرم ها سبب مهار آنزیم و تداخل در آزمایش می گردد و یا وجود بقایای دترجنت در ظرف و لوله های نگهداری سرم یا آماده سازی محلول شستشو، سوبسترا و همچنین وجود مواد نگهدارنده Preservative مانند سدیم آزاید در پول سرم و سرم کنترل نیز سبب مهار آنزیم و تداخل در تست های CIA می شود.
وجود آلودگی در ظروف و لوله های مصرفی و نگهداری که ممکن است دارای بقایای خون یا پروتئین یا باکتری و قارچ ها بوده که این آلودگی ها سبب تداخل در واکنش آنتی ژن- آنتی بادی و یا تخریب و دناتوره شدن آنتی بادی می شود.
در اکثر موارد پزشکان تقاضای انجام تست در روز و تاریخ مشخصی را دارند که انجام دقیق این کار الزامست مثلاً تقاضای تست FSH , LH در روز ۱۴ عادت ماهیانه یا انجام تست تیروئیدی یکماه بعد از درمان و یا کنترل تستوسترون بعد از درمان موارد خاص که در این موارد انجام دستور پزشک ضروریست.
بسیاری از بیماریهای غیر هورمونی حتی سرماخوردگی و عفونتهای مختلف سبب تغییر نتایج می شود که در این مورد توصیه شده طبق دستور پزشک معالج و در حالت سلامت از بیمار خونگیری شود.
برخی از تست ها نیاز به رعایت زمان بندی خاص و استاندارد دارند مثلاً تست مهار دگزامتازون که در ساعتی خاص پس از مصرف مقدار مشخص یا تستهای تحریکی هورمون رشد پس از مصرف داروی ویژه ضروریست و یا در تستهای تحریکی TRH نیز باید زمان خاص خونگیری طبق دستور پزشک رعایت شده که در غیر این صورت سبب خطای نتایج خواهد شد.
بعضی از هورمونها در طول روز تغییرات مشخصی دارند که زمان نمونه گیری بر حسب پیک ترشح آنها در نتایج موثر است مثلاً ACTH و کورتیزول در ساعت بین ۸-۶ صبح بیشترین و بین ساعتهای ۵-۳ کمترین مقدار را دارند.
بسیاری از هورمونها در سنین مختلف غلظت های متفاوتی دارند مثلاً تبدیل محیطی T4 به T3 در نوزادان و افراد میانسال متفاوت است همچنین هورمونهای جنسی در سنین مختلف دارای غلظتهای مختلفی می باشند ، در نوزادان در چند روز اول تولد میزان T4 و TSH بالاتر از مقدار طبیعی است.
مقادیر هورمون ها در بعضی موارد در زن و مرد متفاوت می باشد و هم چنین پاسخ هر جنس نسبت به تستهای تحریکی هورمون متفاوت است مثلاً پاسخ TSH نسبت به تزریق TRH در مردان آهسته تر از زنان است.
حرکات شدید فعالیت بدنی، دویدن، سریع راه رفتن سبب تغییر غلظت بعضی از هورمونها می گردد که اغلب در حالت ذکر شده مقدار آدرنالین، نور آدرنالین، متانفرین، نورمتانفرین، کورتیزول افزایش می یابد توصیه شده است که بیمار قبل از خونگیری مدت ۱۵ دقیقه با آرامش جسمی و روانی بنشیند و بعداً خونگیری انجام گیرد تستوسترون و آندروستندیون و LH در اثر ورزش طولانی مدت افزایش می یابد.
مصرف بعضی از مواد غذایی و نوشیدنیها قبل از انجام تستهای هورمونی سبب تغییر در نتایج تست ها می گردد. مثلاً مصرف قهوه و چای به مقدار زیاد به علت داشتن کافئین سبب تحریک کاتکول آمین ها و افزایش آن میشود یا مصف موز، انبه، گوجه، آناناس به مقدار زیاد سبب افزایش سروتونین ۵HIAA.5HT می گردد که توجه به رژیم غذایی بیمار در این موارد ضروریست.
مصرف دخانیات بر بسیاری از تستها منجمله تستهای هورمونی تاثیر می گذارد از جمله سبب افزایش موادی همچون آدرنالین و کورتیزول و غیره می شود توصیه می گردد قبل از نمونه گیری جهت آزمایشگاه هورمونی از مصرف دخانیات خودداری شود.
داروها و متابولیتهای آنها اثر زیادی بر روی تستهای هورمونی دارند، برخی از این اثرات عبارتند از:
اثرات فیزیولوژیک داروها یا متابولیتهای آنها در حالت داخل بدن In vivo اعمال می شود ولی اثرات آنها در خارج بدنIn vitro سبب تداخل در اندازه گیری هورمونها می گردد بعنوان نمونه مصرف کاربامازپین و فنی توئین و دارو های ضد افسردگی سبب کاهشT4 وFT4 به میزان ۱۵% می گردد، مصرف داروهای ضد حاملگی خوراکی (OCP) یا داروهای ضد حاملگی تزریقی حاوی استروژن سبب افزایش پروتئین های حامل و هورمون می شود.
تغییر موقعیت بیمار از حالت درازکش به نشسته یا ایستاده سبب تغییر حجم مایع داخل و خارج عروقی و به نوبه خود تغییر غلظت هورمون ها می گردد، در حالت ایستاده نتیاج تست هورمونی ۱۰- ۵ بالاتر از حالت نرمال است. (به علت خروج مایعات از رگ Hemoconcentration) توصیه بر این است که همواره خونگیری از بیمار به صورت نشسته و بازوی بیمار در سطح قلب آن باشد.
بستن تورنیکت به مدت بیش از یک دقیقه سبب افزایش فشار هیدرواستاتیک وریدها و ایجاد تغییر حجم مایع نمونه بدلیل خروج مایعات از رگ باعث غظلت هورمونها در سرم می گردد و افزایش حدود ۱۰- ۵ بالاتر از حالت نرمال است لذا توصیه می شود در صورت پیدا نکردن ورید باید پس از یک دقیقه تورنیکت باز شده و پس از ۲- ۱ دقیقه دوبار جهت خونگیری بسته شود.
استرس و اضطراب هیپرونتیلاسیون سبب تغییر ترشح هورمونها و غلظت آن می شود توصیه به حالت آرامش کامل می گردد.
روش استاندارد نمونه گیری تستهای هورمونی
بیمار باید رژیم غذایی عادی داشته باشد و شب در ساعت معمول بخوابد، حداقل یکساعت قبل از نمونه گیری از خواب بیدار شده باشد در آزمایشگاه ۱۵- ۱۰ دقیقه با آرامش بنشیند، زمان بستن تورینگ حداکثر یک دقیقه بیشتر نباشد حجم لازم جهت تکرارهای احتمالی تست ها گرفته شود و برای شفافیت سرم نمونه ۶- ۴ ساعت قبل از خونگیری غذا نخورده باشد.
نمونه ادرار جهت تستهای هورمونی
تست های هورمونی اغلب بر روی ادرار بیست وچهار ساعته انجام می گیرد و برای اینکار از ظرف پلاستیکی کدر با حجم کافی و درب دار و دهان گشاد خشک و تمیز استفاده شود، دستور جمع آوری ادرار ۲۴ ساعته بدین صورت است که صبح ادرار اولیه که در مثانه ذخیره شده بود تخلیه و دور ریخته شود و بعد از آن تا آخرین ادرار صبح فردا جمع آوری گردد از مواد محافظ نگهداری توصیه می شود از ۱۵ سی سی استیک -گلاسیال برای کاتکولامین ها، VMA، SHIAA، HCG و پرگناندیول ۱۵ گرم اسیدبوریک برای استرادیول FSH، LH، ۱۷OH کتواستروئیدها استفاده گردد.
انتقال نمونه ها :
جمع آوری و انتقال خون، سرم و ادرار جهت تستهای هورمونی باید در شرایط استاندارد صورت گیرد. نمونه خون نیم ساعت پس از نمونه گیری سانتریفیوژ شده و سرم جدا شود ( حداکثرتا ۲ ساعت باید جدا گردد) دور سانتریفیوژ( PCR) بین ۱۰۰۰- ۸۵۰ واحد g برای مدت ۶ دقیقه باشد که برای سانتریفیوژ معمولی رومیزی معادل ۲۰۰۰- ۱۵۰۰ دور در دقیقه (rpm) میباشد سرم با سر سمپلریکبار مصرف نو ( مصرف نشده) جدا شده و در یک لوله پلی اتیلن درب دار نو ریخته و در یخچال نگهداری شود.
تبخیر نمونه : نمونه در صورتی که بصورت در باز نکهداری شود تبخیر شده و عوامل تبخیر بستگی به موارد زیر دارد:
نگهداری نمونه:
در جریان نگهداری نمونه تا موقع آزمایش ممکن است ترکیبات موجود در سرم یا نمونه تغییر کند این تغییر به دلائل مختلف مانند جذب به شیشه و پلاستیک، دناتوره شدن پروتئین ها، تبخیر ترکیبات فرار (Volatile) و آب سرم، فعالیت متابولیک و غیره می توان صورت گیرد.
روشهای نگهداری نمونه ها جهت آزمایشات هورمونی عبارتند از :
اگر آزمایش هورمونی تا دو روز پس از جدا شدن سرم انجام گیرد میتوان نمونه را در یخچال ۴ درجه نگهداری نمود در صورتی که زمان ازمایش طولانی تر است نمونه در فریزر ۲۰- درجه باید نگهداری گردد باید توجه داشت یخچالهای معمولی که فریزر در بالا دارند حداکثر تا ۱۰- درجه می رسند و قادر به نگهداری اینگونه نمونه ها نیستند و نگهداری مدت و یا نمونه جهت انجام تستهای خاص مانند ( رنین پلاسما) استفاده از فریزر ۷۰- درجه ضروریست باید اذان داشت نمونه ها حتی در فریزر هم دچار تغییرات می گردد چون آب نمونه به کریستالهای یخ تبدیل می شوند که سبب پاره شدن یک خط کریستالهای کوچکتر تشکیل شده و آسیب کمتر است توصیه می شود نمونه مورد نظر آزمایش هورمونی در Deep Freeze منجمد شوند توجه گردد که نمونه قرار گرفته در فریزر نباید قبل از انجام آزمایش ذوب شود اینکار سبب تغییرات زیادی می شود.
آماده سازی نمونه :
قبل از انجام تست پس از خارج کردن نمونه ها از فریزر باید در حرارت اطاق ذوب شوند و اینکار باید یکی دو ساعت قبل از آزمایش صورت گیرد که در اثر ذوب شدن نمونه ها معمولا دو فاز ۱- فاز آبکی روی و ۲- فاز غلیظ تر زیرین با مخلوط کردن Vortex mixer نمونه هموژن گردد.
کنترل کیفی متغیرها حین آزمایش
الف : کیتهای کمی لومینسانس الایزا
کیت های کمی لومینسانس باید با حفظ زنجیره سرد به مصرف کننده تحویل شود رعایت نکردن و عدم نگهداری کیتها در حرارت ۸- ۲ درجه سانتیگراد بدون یخچال موجب اشکالات زیادی خواهد شد پس از دریافت کیت تاریخ انقضای بر روی جعبه و همچنین تک تک محتویات کیت باید بررسی شود چون تاریخ انقضای اجزاء متفاوت شاید فرق کند سپس بعد از باز شدن درب آن و مطالعه دقیق بروشور کیت توجه به تمام موارد ذکر شده ضروری است.
پس از هر بار استفاده از کیت باز گرداندن آن در اسرع وقت به یخچال الزامی است کیت باید قبل از استفاده به حرارت اطاق رسانده شود حل کردن استانداردهای لیوفیلیزه موجود باید توسط پیپت های ولومتریک Volumetric و آب مقطر دوباره تقطیر انجام شود بهتر است از وسایل و پیپت های پلاستیکی یکبار مصرف جهت حل کردن محلولها و مواد و رقیق نمودن آنها و انتقال به ظروف دیگر استفاده گردد.
شستشو: در کلیه واکنشهای ایمونواسی مقدار ثابتی از ماده نشاندار شده به همه اضافه می شود کهس از انجام واکنش آنتی ژن و آنتی بادی و اضافه نمودن کونژوکه باید مولکولهای اضافی و سایر مواد از محیط خارج شوند لذا جهت خروج اتصالهای غیر اختصاصی شستشو صورت می گیرد. انتخاب محلول شستشو بستگی به نوع اتصالهای مولکولهای نشاندار به فاز جامد لوله یا بید دارد انواع اتصال مولکولهای جامد عبارتند از :
از مراحل شستشو جهت جدا کردن اتصال غیر اختصاصی مواد استفاده می شود و برای شکستن پیوندهای یونی و جداسازی اتصال غیر اختصاصی از محلول های نمکی استفاده می شود البته غلظت نمک و قدرت یونی محلول شستشو متفاوت است افزایش غلظت یونها تا جائی ممکن است که به پیوندهای اختصاصی Ag- Ab نشاندار شده صدمه ای نرساند.
جهت جدا کردن اتصال غیر اختصاصی از نوع هیدروفوب معمولاً از محلولهای حاوی دترجنت استفاده می شود که نوع و غلظت آن مهم است در صورتیکه اتصال غیر اختصاصی از نوع مخلوط پیوندها باشد استفاده از محلولهای شستشو حاوی نمک مثل nacl و دترجنت بهتر است توجه به نوع و غلظت محلول شستشو اهمیت زیادی دارد چون ممکن است سبب جدا شدن پیوندهای Ag- Ab نشاندار گردد و برای حفظ اینگونه پیوندها غالباً از محلولهای شستشوی باز با PH= 7 استفاده می شود. روش شستشو و تعداد دفعات و حجم آن توسط سازنده کیت تعیین می گردد محلول شستشو اغلب بصورت تغلیظ شده در کیت موجود است که در هنگام استفاده به نسبت ذکر شده بدقت و با آب مقطر رقیق شود.
کنترل کیفی در مرحله شستشو به قرار ذیل است:
کنترل کیفی کیتهای کمی لومینسانس:
انجام آزمایش و کنترل جهت اطمینان از کیفیت کیت های مصرفی کمی لومینسانس توسط سازمان جهانی بهداشت WHO و انجمن بین المللی شیمی بالینی IFCC توصیه شده است.
انجام تست با سرم کنترل معتبر و یا با Pooled Serum 10 بار متوالی در یک RUN یا در ۱۰ روز پیاپی Between run تکرار شود و میانگین md، انحراف معیار SD و ضریب تغییرات CV آن محاسبه گردد.
مقدار قابل قبول CV عبارتست از:
Within run cv ≤ ۲-۳% Between run cv ≤ ۵%
تست با سرم کنترل معتبر هورمونی تکرار شده و میانگین بدست آمده با عدد مورد انتظار سرم کنترل مقایسه شود و درصد عدم صحت محاسبه شود.
عدم صحت مجاز کیتها کمتر از ۲±% X100 %Bias =
تست با سرم معتبر پا لوله مورد نظر با رقمهای مختلف ( ، ، ، ، ۱ ) انجام شود و محدوده خطی بودن کیت تعیین گردد.
درصد خطا در هر دقت از مقدار مورد انتظار محاسبه شود حداکثر خطای قابل قبول کمتر از ۲% باشد کیتهای کمی لومینسانس با کیفیت مناسب باید در محدوده وسیعی از غلظت آنالیت ها به صورت خطی باشد.
با مخلوط نمودن سرم بیمار با سرم حاوی غلظت بالای آنالیت به نسبت مساوی و انجام تست بر روی مخلوط مزبور و مقایسه جواب بدست آمده با مقدار مورد انتظار درصد Bias طبق فرمول چنین محاسبه می شود :
X100 %Bias = ₌ مقدار مورد انتظار
درصد خطای قابل قبول باید ۲ % باشد.
عبارت از حداقل آنالیت قابل اندازه گیری با یک X کیت می باشد. جهت تعیین محدوده تشخیصی ، سرم کنترل با رقت های متوالی آزمایش شده تا حدی که دیگر آنالیت مورد نظر قابل اندازه گیری نباشد و با این روش حداقل غلظت قابل اندازه گیری توسط یک کیت محاسبه می گردد.
با استفاده از سرم کنترل معتبر هر روز با حل شدن ریجنت های کیت گذاشته گردد و تا زمانی که جوابها در محدوده قابل قبول باشد کیت پایدار می باشد.
با استفاده از سرم کنترل معتبر هر ماه تست مورد نظر با کیت مزبور انجام گیرد و زمان پایداری طولانی مدت کیت تعیین میشود تا پایان تاریخ انقضای کیت هر ماه صورت گیرد نتایج در محدوده۲SD Mean باشد.
با تعدادی سرم حدود ۲۵ تست با کیت مورد نظر و یک کیت استاندارد مشابه انجام شده و نتایج مقایسه می شود و به عنوان تست آماری، ضریب همبستگی (r) تعیین می شود محدوده قابل قبول عبارتست از ضریب همبستگی بین ۹۷% تا ۰۳/۱ باشد. (r=0.97 – ۱٫۰۳)
به معنی وجود واکنش متقاطع یا اختصاصی بودن آنتی بادی مورد نظر برای سایر آنالیتها مشابه این تست پیچیده بوده و نیاز به سرم فاقد یک آنالیت می باشد اختصاصی بودن یک کیت باید ۹۹% باشد.
اینکار به معنی انجام تست با سرم کنترل مشخص و تهیه نسبتهای مختلف از آن با سرمهای همولیز، لیپمیک، یرقانی و غیره می باشد و مشاهده اثرات آنها در نتایج مورد انتظار تستها می باشد سپس مقدار تداخل هر ماده در نتایج تست ها تعیین خواهد شد و محدوده عدم تداخل نیز مشخص می گردد.
۱۱- پدیده لبه Edge effect:
در روشهای ایمونواسی در مرحله انکوباسیون لوله ها، بیدها و چاهک های کوت شده با آنتی بادی یا آنتی ژن مقدار حرارت رسیده به قسمتهای مختلف لوله یا بید کمی متفاوت است و این مسئله سبب مقداری خطا می گردد که این پدیده در روشهای کمی لومینسانس اهمیت زیادی دارد.
چسباندن آنتی ژن یا آنتی بادی در مرحله انکوباسیون لوله ها، چاهک و بید بر مبنای پیوند غیر کووالانسی مستقیم می باشد که ۲۵% آنتی بادی به دیواره ها و ۷۵% آن به کف چسبیده می شود که از این آنتی بادی چسبیده به دیواره و کف تنها ۵/۱ درصد کل آن از نظر ایمونولوژیکی فعال است چون آنتی بادی از نظر شکل فضایی و سه بعدی به سطوح مختلف چسبیده اند.
در واکنشهای ایمونولوژیک و روشهای ایمنواسی در صورتی که مقدار آنالیت مورد نظر خیلی بیشتر از آنتی بادی بکار رفته در واکنش باشد لذا تعداد کمپلکس آنتی ژن- آنتی بادی کمتر از آنالیت مورد نظر خواهد بود که این امر باعث پاسخ منفی کاذب می گردد نام این پدیده از شکل منحنی که مانند قلاب است گرفته شده دو نوع پدیده هوک وجود دارد:
بحث نهایی اینکه در کنترل کیفی روش کمی لومینسانس همانند بخشهای دیگر با سرم کنترل تجاری می توان بررسی کنترل کیفی صورت گیرد.
کمی لومینسانس:
لومینسانس ساطع شدن انرژی نورانی در زمانی که یک الکترون از حالت تحریک شده خود (منبع بالا تری از انرژی) به سطح پایین تر از سطح انرژی نزول می کند.
پدیده هایی مانند فلورسانس یا فسفرسانس از انواع لومینسانس هستند. در این واکنشها انرژی نورانی به ماده ای تابیده شده و توسط ماده مذبور جذب می گردد. در اینحالت الکترونها با جذب انرژی به سطح بالاتری ارتقاع می یابد هنگامی که این الکترون به وضعیت اولیه خود باز می گردد از خود انرژی نورانی ساطع می نماید که این انرژی به شکل زیر محاسبه می شود:
E= h
E = انرژی
h = ضریب ثابت پلانک برابر ۶٫۶۳ x 10-27 Erg/Sec
C = سرعت نور
= طول موج
بدیهی است در آزمایشهایی که بر اساس واکنش های فوق بنا نهاده شده است آنچه مورد نظر است اندازه گیری شدت نور یا انرژی ساطع شده می باشد.
در واکنش کمی لومینسانس نیازی به استفاده از منبع خارجی برای تابیدن نور نمی باشد. به عبارت ساده تر کمی لومینسانس در اثر ساطع شدن نور به علت یک واکنش شیمیایی رخ می دهد. به این معنی که متعاقب یک واکنش شیمیایی (عموماً اکسیداسیون) که در نتیجه نقل و انتقال الکترونها مقدار زیادی انرژی به صورت فوتون آزاد می گردد. به عبارت دیگر در کمی لومینسانس انرژی شیمیایی به انرژی الکترومغناطیسی تبدیل گشته که در نهایت به ساطع شدن نور به صورت فوتون منجر می گردد.
یک تفاوت اساسی میان واکنشهای فلورسانس و کمی لومینسانس وجود دارد. در فلورسانس یا واکنشهای مشابه به دلیل وجود یک منبع نورانی برای شروع واکنش، اندازه گیری باید با توجه به میزان نور زمینه Background صورت پذیرد. در صورتیکه در کمی لومینسانس، از آنجا که منبع نورانی جهت آغاز واکنش وجود ندارد، نور زمینه عملاً صفر بوده و همین امر سبب می گردد که کمی لومینسانس از جمله حساسترین روشهای موجود برای اندازه گیری در Immunoassay باشد.
از دیگر اختصاصات آن است که فی الواقع به ازاء هر مولکول یک واکنش اکسیداسیون رخ می دهد که منجر به ساطع شدن مقدار معینی انرژی به صورت فوتون می گردد از این رو واکنشهای کمی لومینسانس از دقت و حساسیت بسیار بالایی برخوردار هستند در صورتیکه در واکنشهای فلورسانس یا فسفرسانس شدت نور حاصله که به عوامل زیادی وابسته است مورد استفاده برای اندازه گیری خواهد بود.
همانگونه که قبلاً گفته شد واکنشهای کمی لومینسانس غالباً از دسته واکنشهای اکسیداسیون است. واکنشهای اکسیداسیون که معمولاً بسیار قوی و پرانرژی هستند و می توانند محصولات میانی یا نهایی را ایجاد نمایند که در هنگام بازگشت به سطح اولیه خود مقدار زیادی انرژی تولید می نمایند به طوری که این انرژی تبدیل به انرژی نورانی می گردد. برای مثال ایجاد یک فوتون رنگ آبی در طول موج ۴۵۰ نانومتر نیاز به ۵/۶۳ کیلو کالری به ازاء هر مول انرژی می باشد.
انرژی آزاد شده در طی واکنشهای کمی لومینسانس به طرق مختلف و با طرق مختلف و با استفاده از ابزارهای گوناگون قابل اندازه گیری است برخی از این روشها شامل استفاده از تیوبهای تشدید کننده نور (Photo multiplier tubes)، دستگاههای
(Charge couple devices)، دیودهای حالت جامد سیلیکونی (Solid state silicon diode )، در روشهای عکسبرداری استفاده نمود.
شایعترین دستگاههای مورد استفاده دستگاههایی هستند که از تیوبهای تشدیدکننده نور Photo Multiplier Tube = PMT استفاده میکنند. در این دستگاهها فوتونهای نوری حاصل از واکنشهای کمی لومینسانس توسط PMT ابتدا به پالسهای الکتریکی بدل شده و پس از افزایش سیگنالهای حاصله به روش دیجیتالی شمارش می گردند. فی الواقع این دستگاهها به نوعی شمارشگر فوتون هستند. (photon counter).
همانگونه که قبلاً ذکر شد به دلیل عدم نیاز به منبع نورانی برای تحریک الکترونها، این دستگاهها اولاً Background صفر دارند، در ثانی نیاز به کالبراسیون ندارند و با توجه به حساسیت بالای آنها قادرند تا کمتر از یک هزار مولکول را در یک نمونه شناسایی نمایند از اینرو از جهت دقت به دستگاههای ELISA حساسیت واکنشهای کمی لومینسانس بر حسب atlo mole (10-18 مول) یا زپتامول Zepta mole ( 10-21 مول) بیان می گردد که حداقل ۱۰۰۰ بار حساستر از واکنشهای ELISA می باشد.
واکنشهای کمی لومینسانس برای اولین بار در سیستم های حیاتی مورد توجه قرار گرفتند. برخی موجودات نظیر کرم شبتاب Fire fly، عروس دریایی Jelly fish از خود نور ساطع می کنند این پدیده بیولومینسانس نام دارد. در این موجودات ماده ای به نام لوسفرین (Luce ferin) موجود است که تحت تاثیر آنزیمی به نام Luci ferase (لوسیفراز) اکسید شده که در فعل و انفعالات الکترونی که به آن اشاره شده، یک فوتون نور آزاد می شود.
لوسفرین و لوسیفراز حساسترین مواد برای جلوگیری در واکنشهای کمی لومینسانس هستند، لیکن به سبب عدم دسترسی مناسب و بهای بالا از مواد دیگری غیر جهت این واکنشهای بصورت شایع تر استفاده می گردید که ذیلاً به آن اشاره خواهد شد.
واکنشهای کمی لومینسانس را عموماً به دو دسته عمده میتوان تقسیم نمود:
اگرچه حساسیت این واکنش ها کمی پایین تر از نوع Flash است اما اولاً این حساسیت به مراتب بیش از میزان مورد نیاز برای اندازه گیری های متداول در آزمایشگاه های تشخیص پزشکی است و در ثانی ماهیت واکنشهای Glow این امکان را فراهم می آورد که شرایط معمول برای انجام واکنش مهیا و در مدت زمان کافی از دستگاههای کمی لومینسانس استفاده میگردد، به عبارت دیگر چنانچه واکنشهای Flash مورد نظر باشند، دستگاههای مورد استفاده حتماً باید اتوماتیک در همان زمان واکنش و انتقال معرفهای لازم، عمل اندازه گیری را انجام دهند. این به معنای هزینه بالای دستگاههای مورد استفاده و حساسیت بسیار بالایی است که ممکن است چندان مورد نیاز آزمایشگاههای تشخیص طبی نباشند. ولی شاید چنین حساسیتی در آزمایشگاههای تحقیقاتی مورد نیاز باشد.
در صورتیکه در واکنشهای Glow بسیاری از عملیات می توانند سر فرصت به صورت دستی انجام شود و در عین حال حساسیت هزاران بار بیشتر از Elisa خواهد بود. بنابراین ضمن تامین حساسیت و دقت برای آزمایشگاههای تشخیص پزشکی استفاده از اینگونه دستگاهها می تواند بسیار مقرون به صرفه باشد.
معرف ها یا Reagent ها در کمی لومینسانس
به طور کلی در واکنشهای کمی لومینسانس دو نوع معرف (Reagent) مورد نیاز است. یک ماده اولیه و دیگر آنزیم یا ماده اکسید کننده که مسبب اکسیداسیون ماده پایه گردیده و سبب ساطع شدن نور می گردد.
در کاربرد آزمایشگاهی بالینی در اینجا نیز اغلب واکنشها بر اساس واکنش آنتی ژن یا آنتی بادی استوار است.
در اینجا نیز معمولاً آنتی بادی (آنتی ژن) بر روی یک فاز جامد ثابت گردیده سپس آنتی ژن یا آنتی بادی باید مورد اندازه گیری قرار گیرد، سپس نمونه مورد آزمایش به چاهک پلیت اضافه می گردد. به دنبال آن با اضافه نمودن آنتی بادی یا آنتی ژن دوم که با معرف کمی لومینسانس کنژوگه شده است که حاوی آب اکسیژنه نیزمی باشد، واکنش مثبت و سپس با اضافه شدن آنزیم حاوی ماده باند شده فعال پایه کمی لومینسانس اکسید شده و نور ساطع می گردد.
شایعترین موادی که در این واکنشها مورد استفاده قرار می گیرد به شرح زیر است:
چنین حساسیت بالایی چندان مورد نیاز اندازه گیری های متداول در آزمایشگاههای تشخیص پزشکی نیست لیکن در برخی زمینه های تحقیقاتی نظیر DNA probe Assay, Report gene assay و آزمونهای کمی PCR Quantilative
Assayمورد نیاز خواهد بود.
این نوع واکنشها نیز از نوع Glow می باشند و امروزه در بسیاری از آزمونها مورد استفاده قرار می گیرد، از شایعترین املاح مورد استفاده : Adamatyl 1,2- Dioxetans aryl phosphate می باشد. به رقم استفاده از واکنش Glow حساسیت این نوع مواد بسیار بالا بوده و میتواند در حدود Zeptamole خواهد بود.
لومینومتر Luminometer
این دستگاه جهت اندازه گیری نور منتشره از واکنشهای لومینسانس ساخته شده که دارای قسمتهای ۱- محل خوانش نمونه ۲- آشکار کننده ۳- قسمت پردازش سیگنال ۴- قسمت خروجی ( نمایشگر)
آشکار کننده Deteetor شامل فتودیود (Photo diode) یا فتو مولتی پلایر PMT که دتکتور Photo multiplier جهت اندازه گیری سطوح نور بسیار پایین رایج است.
در فتومولتی پلایر، هر فوتون ورودی سبب ایجاد آبشاری از الکترونهای تکثیر یافته می شود که این تکثیر بسیار سریع بوده و تکثیر الکترونی آن فوق العاده است. البته فتومولتی پلایر بدون صورت ۱- در کنار (Side-on) 2- زیر محفظه نمونه (End-on) قرار می گیرد نوع دوم کیفیت جمع آوری نور بیشتری را دارد و مناسب تر است.
کنترل کیفی دستگاه لومینومتر
صحت لومینومتری یا کمی لومینومتری از معیارهای مهم در انتخاب دستگاههای لومینومتر است. روشهای متعددی جهت کنترل کیفی صحت لومینومتریک وجود دارد : ۱- استفاده از لامپ های استاندارد دارای کمی لومینسانس مشخص از لامپ های تنگستن (tungsten) و لامپ های کوارتز- ید (quartz-iodine) کالیبره شده توسط موسسه بین المللی استانداردها NBS جهت این کار استفاده می شود.
شدت نشر نور ساطع شده (emitted light) از این لامپ ها در شرایط کنترل شده دقیقاً مشخص و معلوم شده است. این لامپ ها جهت کنترل کیفی و کالیبراسیون دتکتور دستگاه لومینومتر بکار می روند.
لامپ فیلامنت تنگستن در حرارت مشخص برای کالیبراسیون دستگاه لومینومتر در محدوده مرئی (Visible) و لامپ کوارتز- ید با جریان ثابت جهت کنترل کیفی و کالیبراسیون دستگاههای لومینومتر مورد استفاده قرار می گیرند. صحیح ترین و معتبرترین روش کنترل کیفی و کالیبراسیون دستگاههای لومینومتر استفاده از لامپ های استاندارد است.
۲- تکرار پذیری :
تکرار پذیری (دقت) دستگاههای لومینومتر از پارامترهای مهم و اساسی هر دستگاه است. برای کنترل کیفی تکرار پذیری از روشهای زیر استفاده می شود:
(a استفاده از استانداردهای کمی لومینومتری با نشر نور مشخص
۱۰ مرتبه پیاپی این استانداردها را با دستگاه قرائت کرده و میانگین، انحراف معیار و ضریب تغییرات نتایج محاسبه می شود. عدم دقت (imprecision) قابل قبول عبارتست از ۱) within run CV و ۲) between run
(b استفاده از سرم کنترل یا سرم بیمار
۱۰ بار تست مورد نظر بر روی سرم کنترل یا سرم یک بیمار به روش کمی لومینسانس انجام شده و کمی لومینسانت حاصله با دستگاه لومینومتر اندازه گیری می شود. معیار محاسبه عدم دقت مشابه موارد فوق می باشد.
خطی بودن دستگاههای لومینومتر از معیار های مهم دستگاههای لومینومتر است. جهت کنترل خطی بودن دستگاه از روش های زیر استفاده می شود:
(a استفاده از استانداردهای ATP :
از استاندارد ATP مورد نظر (با غلظت مشخص) رقت های ، ، ، و …. تهیه می شود ( با سمپلر و وسایل حجمی صحیح) رقت های مربوطه به دستگاه لومینومتر داده شده و شدت نور ساطع شده کمی لومینسانس اندازه گیری می شود و خطی بودن نتایج کنترل می شود. در صورت مشاهده خطی نبودن دستگاه تکرار روش ذکر شده به روشهای استاندارد و صحیح تهیه رقت ضروری است. حداکثر خطای قابل قبول (عدم خطی بودن دستگاه)۱ % از مقدار مورد انتظار است.
(b استفاده از استانداردهای کمی لومینومتری معتبر
(c استفاده از روش تهیه رقت از سرم کنترل یا سرم بیمار
کنترل عدم صحت و عدم دقت دیسپنسر نمونه به روش زیر انجام می گیرد:
الف) روش وزن سنجی
ب) روش رنگ سنجی
حداکثر عدم صحت مجاز ۱ % و عدم دقت مجاز ۲ % است.
کنترل عدم صحت و عدم دقت پمپ تزریق رآژنت به روشهای ذکر شده فوق صورت می گیرد.
حداکثر عدم صحت مجاز ۱ % و عدم دقت مجاز ۲ % است.
چون حساسیت از خصوصیات عمده و بارز روشهای کمی لومینومتری (CLIA) است، دستگاه لومینومتر باید دارای حساسیت زیادی باشد. کمترین مقدار قابل تشخیص به معنی سیگنال قابل اندازه گیری بالاتر از بلانک بوده، نشان دهنده حد حساسیت دستگاه لومینومتر است. جهت کنترل حساسیت دستگاههای لومینومتر استفاده از استانداردهای شناخته شده (با غلظت معلوم) و مقایسه نتایج بدست آمده با نتایج مورد انتظار توصیه می شود. با مقایسه نتایج بدست آمده از استانداردهای معلوم العیار، نمونه ها و رآژنت های مشابه، حساسیت دستگاه تعیین می شود.
با رقیق کردن پیاپی استاندارد با غلظت مشخص و کمی لومینسانس معین، حداقل مقدار قابل اندازه گیری کمی لومینسانس توسط دستگاه تعیین می شود که همان حساسیت دستگاه لومینومتر است.
محدوده تشخیصی پایین تر به معنی اندازه گیری سطوح نشر نوری پایین تر است. هرچه محدوده تشخیصی دستگاه لومینومتری کمتر باشد، علاوه بر افزایش حساسیت تستها، کاهش میزان نمونه و رآژنت مصرفی نیز ممکن خواهد بود.
یکی دیگر از راههای تعیین محدوده تشخیصی و حساسیت دستگاههای لومینومتر، اندازه گیری مکرر بلانک و تعیین میانگین و انحراف معیار آن است.
محدوده تشخیصی یک دستگاه عبارتست از میانگین نشر نوری بلانک به اضافه یا منهای ۲ انحراف معیار
Detection limit = mean OD blank ۲SD
هرچه محدوده تشخیصی دستگاه کمتر باشد، حساسیت آن بیشتر و کیفیت و کارآیی آن بهتر است.
یکی دیگر از راههای تعیین حساسیت دستگاههای لومینومتری مقایسه نتایج بدست آمده از آزمایش موازی یک تعداد نمونه سرم کنترل یا سرم بیمار بین دستگاه مورد نظر و دستگاه دیگر است.
کنترل تمام مدهای محاسباتی و برنامه های عملکردی دستگاه در موقع شروع به کار آن و در فواصل مرتب توصیه می شود.
پایداری دستگاه لومینومتر در طول زمان از پارامترهای مهم انتخاب دستگاه به شمار می شاید. جهت کنترل پایداری دستگاه از استانداردهای کمی لومینسانت، سرم کنترل یا سرم بیمار در ابتدای کار دستگاه استفاده شده و فواصل یکساعته تست را انجام داده و تنایج بدست آمده و کمی لومینسانس حاصله را مقایسه می کنند. حداکثر تفاوت بین نتایج در زمان های ذکر شده ۱ % است.
دستگاههای لومینومتر پایدار پس از ساعتهای پیاپی کار هیچگونه تغییر یا رانش (drift) نشان نمی دهند.
